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中國海洋大學(xué)李德海教授近年來研究進(jìn)展概覽

2019-12-11 14:01經(jīng)驗(yàn)交流

簡介" 本文來自微信公眾號(hào)：X-MOLNews 李德海，中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院教授，博導(dǎo)。2002年畢業(yè)于山東大學(xué)藥學(xué)院，獲學(xué)士學(xué)位；2002年至2007年于中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院碩博連讀獲藥物化學(xué)博士學(xué)位（導(dǎo)師：顧謙群教授）；2007年7月至2009年7月在加拿大University of Br...

本文來自微信公眾號(hào)：X-MOLNews

李德海，中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院教授，博導(dǎo)。2002年畢業(yè)于山東大學(xué)藥學(xué)院，獲學(xué)士學(xué)位；2002年至2007年于中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院碩博連讀獲藥物化學(xué)博士學(xué)位（導(dǎo)師：顧謙群教授）；2007年7月至2009年7月在加拿大University of British Columbia進(jìn)行海洋藥物博士后研究（Raymond J Andersen課題組）。2009年9月經(jīng)中國海洋大學(xué)“青年英才工程”引進(jìn)加入醫(yī)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室。2014年8月至2015年8月期間以訪問學(xué)者身份赴美國加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA，Yi Tang 課題組）從事真菌基因組采掘和合成生物學(xué)研究。

近年來主持國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目3項(xiàng)，還獲得教育部 “新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”（2012）、“山東省自然科學(xué)杰出青年基金”（2014）、青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室“鰲山人才”優(yōu)秀青年學(xué)者計(jì)劃（2015年）等項(xiàng)目支持。獲國家海洋局2015年度優(yōu)秀科技青年（2015年）、山東省自然科學(xué)學(xué)術(shù)創(chuàng)新獎(jiǎng)（2016年）、中國藥學(xué)會(huì)-以嶺生物醫(yī)藥獎(jiǎng)（2018年）等。發(fā)表論文100余篇，其中以第一或通訊作者在Curr. Opin. Biotech.、Org. Lett.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod. 等期刊上發(fā)表SCI收錄論文70余篇，H指數(shù) = 33 (Google scholar數(shù)據(jù))；被JACS、ACIE 等SCI期刊論文引用1200余次（他引900余次）。獲授權(quán)國家發(fā)明專利8項(xiàng)。兼任中國藥學(xué)會(huì)海洋藥物專業(yè)委員會(huì)委員和“海洋藥物博士論壇”青年委員會(huì)委員及主任；中國海洋湖沼學(xué)會(huì)藥學(xué)分會(huì)理事、副秘書長。

新型藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)是創(chuàng)新藥物研究的核心問題之一；海洋微生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物新穎多樣，是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。李德海教授多年來一直從事海洋天然藥物化學(xué)研究，聚焦海洋微生物，圍繞腫瘤、感染等重大疾病，從中發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物。近年來主要研究進(jìn)展包括以下幾個(gè)方面：

1. 海洋來源微生物中新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)研究

天然化合物具有高度的新穎性，同時(shí)也具有復(fù)雜的三維立體結(jié)構(gòu)和廣泛的生物活性類型，如何準(zhǔn)確的闡明其精細(xì)構(gòu)型并發(fā)現(xiàn)其中潛在的藥用價(jià)值，是海洋天然藥物化學(xué)研究過程中最具挑戰(zhàn)的部分。針對(duì)此，近年來利用手性拆分、重金屬誘導(dǎo)ECD、量子化學(xué)計(jì)算和實(shí)驗(yàn)譜學(xué)相結(jié)合等新技術(shù)，從海洋來源微生物中獲得了300余個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的復(fù)雜天然產(chǎn)物；重點(diǎn)針對(duì)腫瘤、感染、心腦血管疾病等重大疾病的多種模型和靶點(diǎn)進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià)，探索海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物學(xué)功能和潛在藥用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)化合物具有細(xì)胞毒、抗病毒、抗菌等功能。這些新穎的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)作用，如psychrophilin G具有潛在的降血脂作用（J. Nat. Prod., 2014, 77, 2218），Naquihexcin A（Org. Lett., 2016, 18, 3358）能夠抑制阿霉素耐藥的腫瘤細(xì)胞生長；新骨架化合物Neosartoryadin A（Org. Lett., 2016, 18, 244）、Anthranoside C（Org. Lett., 2018, 20, 5466）具有抗流感病毒活性；含硫橋化合物Penicisulfuranol A（J. Nat. Prod., 2017, 80, 71）可以靶向熱休克蛋白90（HSP90）發(fā)揮腫瘤細(xì)胞抑制作用。這些新穎的結(jié)構(gòu)和潛在的藥用價(jià)值為國際創(chuàng)新藥物開發(fā)和合成化學(xué)研究提供了新的模板結(jié)構(gòu)，其中紅樹林內(nèi)生真菌產(chǎn)生的Penicitol A（J. Nat. Prod., 2015, 78, 306）、海綿共附生真菌產(chǎn)生的Speradine C（Tetrahedron, 2015, 71, 3522）和Stachybotrin G （Tetrahedron Lett., 2015, 56, 7053）、深海來源真菌中發(fā)現(xiàn)的Clindanones A和B（RSC Adv., 2016, 6, 76498）等10個(gè)分子被天然產(chǎn)物權(quán)威評(píng)論性期刊Nat. Prod. Rep.評(píng)為“熱點(diǎn)化合物”（Hot off the press）。

圖1. 報(bào)道的部分新結(jié)構(gòu)化合物。

2. 海洋藥用微生物資源的開拓和挖掘利用

（1）深遠(yuǎn)海藥用微生物新資源的開拓

針對(duì)近淺海生物資源重復(fù)研究嚴(yán)重的問題，積極開拓了深遠(yuǎn)海微生物藥用新資源。深海環(huán)境獨(dú)特、資源豐富，但深海樣品采集和微生物培養(yǎng)難度大，代謝產(chǎn)物的研究起步晚、發(fā)現(xiàn)少，1984年才有第一篇文獻(xiàn)。相對(duì)于海洋天然產(chǎn)物目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3萬余個(gè)新化合物，深海來源的化合物至2017年底相關(guān)研究僅報(bào)道了400余個(gè)新結(jié)構(gòu)，是亟待開發(fā)利用的藥用新資源。該課題組發(fā)揮中國海洋大學(xué)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室在深海樣品采集方面的技術(shù)和裝備優(yōu)勢，搭乘20余個(gè)科考航次，采集獲得200余份深海樣品，覆蓋印度洋、太平洋、南極、北極海域，最深超過9000米；不斷探索深海微生物的分離培養(yǎng)技術(shù)，獲得了1500余株深海來源真菌和放線菌，建立了深海微生物菌種資源庫，推動(dòng)了“藍(lán)色藥庫”開發(fā)計(jì)劃中的海洋微生物資源庫的建設(shè)。對(duì)深海來源菌株進(jìn)行篩選獲得了近百株活性菌株，完成了其中10余株真菌的深入研究，發(fā)現(xiàn)了新化合物70余個(gè)，開拓了深遠(yuǎn)海藥用微生物新資源。

圖2. OSMAC策略指導(dǎo)下，通過改變培養(yǎng)條件對(duì)一株深海來源真菌的挖掘。

（2）海洋來源微生物自身代謝潛能的挖掘利用

常規(guī)模式下微生物大部分編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的生合成基因處于沉默狀態(tài)（Cryptic Pathway），而這些“沉默基因”有可能編碼更為新穎的活性化合物，巨大的代謝潛能亟待挖掘利用。如何激活“沉默基因”，挖掘微生物自身的代謝潛能，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物，是海洋天然藥物研究亟待解決的學(xué)術(shù)難題。在化學(xué)篩選和活性篩選基礎(chǔ)上，融合“基因篩選” 等多維篩選技術(shù)尋找具有潛在新結(jié)構(gòu)化合物產(chǎn)生能力的“潛力菌株”；并逐步完善了以O(shè)SMAC （J. Nat. Prod., 2015, 78, 2699; Tetrahedron, 2015, 72, 3715）策略、表觀遺傳修飾（J. Nat. Prod., 2015, 78, 2841; Arch. Pharm. Res., 2018, 41, 57; J. Nat. Prod., 2019, 82, 998）、共培養(yǎng)（J. Nat. Prod., 2017, 80, 3167; J. Nat. Prod., 2018, 81, 1651）、基因組采掘（RSC Adv., 2015, 29, 22777; J. Nat. Prod., 2017, 80, 1684; Org. Lett., 2017, 19, 5376）等新興技術(shù)為代表的“沉默基因”激活手段，實(shí)現(xiàn)了從環(huán)境因子到基因水平的多層次海洋微生物代謝潛能挖掘利用技術(shù)體系。

如紅樹林海洋樣品中獲得的鏈霉菌Streptomyces sp. CHQ-64經(jīng)過多維篩選，表明可能含有PKS、NRPS等基因簇、代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富、具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性�；钚宰粉櫤突瘜W(xué)追蹤獲得系列雜合NRPS和異戊二烯途徑的HI類生物堿Indotertines和drimentines，其中indotertine B（IC50：4.88-6.96 μM）和drimentine G（IC50：1.01-2.81 μM）對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有廣泛的抑制作用，并證實(shí)化合物drimentine G能夠作用于TOPO I 這一抗腫瘤靶點(diǎn)（Org. Lett., 2012, 14, 3438；J. Nat. Prod., 2013, 76, 759）。在基因篩選結(jié)果的指導(dǎo)下分析該菌株的基因序列，發(fā)現(xiàn)了具有產(chǎn)生多烯多醇結(jié)構(gòu)的PKS基因簇，針對(duì)多烯多醇結(jié)構(gòu)的特征核磁信號(hào)，從不具有細(xì)胞毒活性的組分中獲得新穎的reenmycine類化合物，具有同制霉菌素相當(dāng)?shù)目拐婢钚裕≧SC Adv., 2015, 5, 22777），補(bǔ)充了單一活性篩選的局限性。進(jìn)一步對(duì)該菌株主產(chǎn)物的正調(diào)控基因（rdmF）進(jìn)行敲除，使其不再產(chǎn)生該類聚酮，導(dǎo)致生源前體的蓄積，從而產(chǎn)生了另一類聚酮化合物，獲得了高活性吡啶生物堿pieridicidin F和含吡咯結(jié)構(gòu)Geranylpyrrol A（J. Nat. Prod., 2017, 80, 1684）。

圖3. 放線菌Streptomyces sp. CHQ-64活性代謝產(chǎn)物挖掘。

而海洋來源真菌Penicillium terrestre 采用OSMAC策略激活產(chǎn)生了具有全新的橋環(huán)連螺環(huán)骨架細(xì)胞毒活性化合物chloctanspirones A-B 和其前體terrestrol K-L（Tetrahedron, 2011, 67, 7913）�；蚪M測序分析表明該菌株至少含有48個(gè)編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物核心骨架的基因簇。在基因組采掘思路指導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)沉默的mac基因簇有可能編碼雜萜類化合物。通過調(diào)控該基因簇中特異性的轉(zhuǎn)錄因子macR，成功激活得到具有環(huán)己烯酮片段的macrophorin類雜萜，隨后通過基因敲除和異源表達(dá)建立了基因簇同化合物之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系；隨后通過體外生化反應(yīng)、蛋白點(diǎn)突變等手段證實(shí)了關(guān)鍵酶macJ 的催化活性位點(diǎn)和初步的催化機(jī)理，揭示了macJ 屬于整合膜蛋白II-型萜環(huán)化酶，并證實(shí)可以直接通過雙鍵質(zhì)子化觸發(fā)環(huán)化反應(yīng)（Org. Lett., 2017, 19, 5376）。

圖4. 以O(shè)SMAC策略和和基因組采掘技術(shù)對(duì)菌株P(guān)enicillium terrestre LM2的沉默基因激活。

該課題組在采用表觀遺傳修飾劑激活海洋微生物沉默基因的過程中，發(fā)現(xiàn)了一株能夠降解常用溶劑二甲基亞砜（DMSO）的真菌。該菌株（Neosartorya udagawae HDN13-313）為紅樹林植物內(nèi)生真菌，對(duì)于表觀遺傳修飾劑5-氮雜胞苷（一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）非常敏感，經(jīng)搖床和靜置培養(yǎng)均可以產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物，通過分離鑒定獲得了含甲磺�；男禄衔�1和2。該課題組發(fā)現(xiàn)，化合物1在僅添加DMSO時(shí)也可以產(chǎn)生，而化合物2則必須在DMSO和5-氮雜胞苷均存在時(shí)才能產(chǎn)生，并最終證明甲磺�；鶃碓从谠咀鳛槿軇┑腄MSO。這是報(bào)道中首次發(fā)現(xiàn)能夠降解DMSO并把降解產(chǎn)物整合到其代謝產(chǎn)物上的真菌。該研究也為探討海洋特殊環(huán)境來源微生物的獨(dú)特代謝機(jī)制提供了線索。此外，甲磺�；笊傻幕衔�2還具有與陽性藥辛伐他汀相當(dāng)?shù)慕抵钚�，提示這一過程對(duì)提高化合物的生物活性也具有一定的意義。這一研究成果以封面文章發(fā)表于J. Nat. Prod.上（J. Nat. Prod., 2019, 82, 998）。

圖5. 以表觀遺傳修飾策略對(duì)菌株Neosartorya udagawae HDN13-313的沉默基因激活。

海洋微生物是重要的海洋藥物新資源，雖然已經(jīng)有超過三萬個(gè)海洋天然產(chǎn)物被報(bào)道，但事實(shí)上對(duì)海洋微生物及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的認(rèn)知和應(yīng)用依然相對(duì)匱乏。海洋特別是深海微生物小分子代謝產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)和生合成關(guān)鍵步驟上是否有其獨(dú)特性？如何產(chǎn)生？有何功能？如何發(fā)掘其代謝潛能并評(píng)估其在醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值？一系列科學(xué)問題均需要更廣泛的知識(shí)積累和深入的微觀研究來解決。隨著更多新技術(shù)和新思路的引用，多學(xué)科的深入交叉融合，相信未來海洋藥用微生物的研究能夠取得突破性的進(jìn)展，推動(dòng)藍(lán)色藥庫開發(fā)夢想的實(shí)現(xiàn)。