前言

濃香型白酒（SFB）在窖泥窖發(fā)酵過(guò)程中獲得了獨(dú)特的風(fēng)味。 窖泥中的微生物是產(chǎn)生風(fēng)味酯的關(guān)鍵前體。 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所（第一工作：劉茂科）在微生物學(xué)�？�“ mssystems”（如果= 6.519）中發(fā)表了題為“中國(guó)白酒期間藝術(shù)性坑泥中原核生物群落的結(jié)構(gòu)功能變化”的文章。 2020年3月，《生產(chǎn)》是結(jié)合宏觀基因組學(xué)，宏觀蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)對(duì)啤酒釀造微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行分析的第一項(xiàng)研究。多組分方法的應(yīng)用可以更全面地了解生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落的代謝過(guò)程變化

標(biāo)題：在生產(chǎn)過(guò)程中，人工窖泥中的原核生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的變化將有助于進(jìn)一步優(yōu)化人工窖泥的培養(yǎng)技術(shù)，提高of州市風(fēng)味酒的質(zhì)量。 濃香型白酒

研究對(duì)象：濃香型白酒，人工窖泥

期刊： mssystes

影響因子：6.519

出版時(shí)間：2020年3月

合作單位：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所

使用Ouyi / Luming生物技術(shù)：TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)，PRM靶向驗(yàn)證，非靶向GC-MS代謝組學(xué) ，LC-MS代謝組學(xué)

的研究背景

通過(guò)白酒的固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行發(fā)酵Lu州風(fēng)味酒是世界上最古老的餾出物之一，年產(chǎn)量為910萬(wàn)噸。 zhou州風(fēng)味酒含有己酸乙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯，乙酸乙酯和其他風(fēng)味酯。 根據(jù)己酸乙酯的含量，Lu州風(fēng)味酒的質(zhì)量可分為不同等級(jí)。 通過(guò)增加己酸乙酯和乳酸乙酯的比例可以提高Lu州風(fēng)味酒的質(zhì)量。 高粱是Lu州風(fēng)味酒發(fā)酵的主要谷物，其中涉及多種源自泥漿的微生物和一種稱為大曲的糖化劑。

礦坑泥漿中的微生物可產(chǎn)生多種小的有機(jī)酸（如己酸，丁酸，乙酸和乳酸），它們是風(fēng)味酯的關(guān)鍵前體，這在很大程度上決定了zhou州風(fēng)味酒的質(zhì)量。 由于成熟泥中特殊的微生物群落，因此只能使用成熟泥來(lái)釀造高品質(zhì)的濃香型白酒。 但是，漿液的自然成熟期超過(guò)20年，嚴(yán)重限制了優(yōu)質(zhì)Lu州風(fēng)味酒的生產(chǎn)。 自1960年代以來(lái)，基于對(duì)天然礦渣泥微生物學(xué)的了解，人們開(kāi)始生產(chǎn)人工礦渣泥，以改善高品質(zhì)zhou州風(fēng)味酒的生產(chǎn)。

通常是通過(guò)將發(fā)酵劑接種到新鮮土壤，天然成熟泥，小麥和豆粕的混合物中，然后在厭氧條件下孵育30至60天來(lái)制備人工窖泥。 目前，有很多栽培方法和分子方法來(lái)研究人工泥漿中的微生物群落。 但是，我們對(duì)人工泥漿中微生物動(dòng)力學(xué)和相關(guān)功能變化的分子機(jī)制以及這種變化在生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)Lu州風(fēng)味酒中的作用的了解仍然有限。

研究流程

結(jié)果顯示為

1。 人工窖泥的理化性質(zhì)

作者從Lu州風(fēng)味酒釀造的初始狀態(tài)和前四個(gè)釀造批次的末期抽取了人工窖泥，每批的釀造時(shí)間為90天。 根據(jù)理化性質(zhì)的分析，在人工礦坑泥的成熟過(guò)程中，樣品的腐殖質(zhì)和有效磷含量分別增加了41.84％和200.00％（P <0.05）（表1）。 隨著時(shí)間的流逝，水，有機(jī)物，pH，總氮，總磷，總鉀，NH4 +和有效鉀的含量保持相似。 表2 Lu州風(fēng)味酒釀造過(guò)程中人工窖泥樣品的理化特性和原核生物群落特征

2 Lu州風(fēng)味酒樣品中總共檢測(cè)到31種風(fēng)味化合物：12種酯，8種醇，6種酸，3種醛和2種酮。 主要調(diào)味劑化合物包括己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯，丁酸乙酯，1-丙醇，3-甲基丁醇，正己醇，2-丁醇，乙酸，丁酸，己酸，異戊酸和乙二醛。 這13種風(fēng)味物質(zhì)占樣品中總風(fēng)味物質(zhì)的95.73％（圖1a）。 己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加（P ＜0.05），并分別在第四批和第三批中達(dá)到最高水平。 從第一批到第二批，乙酸乙酯的含量顯著下降（P <0.05）（圖1b）。 己酸乙酯與乳酸乙酯的比例從0.81穩(wěn)定增加到2.77（P ＜0.05），表明Lu州風(fēng)味酒的質(zhì)量得到了改善（圖1c）。

圖1 zhou州風(fēng)味酒釀造過(guò)程中風(fēng)味化合物的動(dòng)力學(xué)

（a）Lu州風(fēng)味酒樣品中風(fēng)味化合物濃度的熱分析圖，紅色是主要化合物。 （b）Lu州風(fēng)味酒樣品中己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯和丁酸乙酯的濃度。 （c）己酸乙酯與乳酸乙酯的比例。 B.第一批； C，第二批； D，第三批； E，第四批。 在

3.16s rRNA基因的擴(kuò)增序列和qpcr

的主成分分析（PCA）中，原核生物群落顯示出批次依賴性聚類（圖2a）。 OTU分為36個(gè)原核生物類別。 在至少一種人造礦坑泥的成熟階段，最豐富的九類是芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌，大腸菌，放線菌，陰性菌，γ-變形桿菌，α變形桿菌，細(xì)菌和增效作用（圖2b）。 通過(guò)qPCR定量最豐富的OTU（梭菌和乳桿菌）。 梭狀芽孢桿菌的濃度在第一批中顯著下降，然后逐漸增加。 乳酸菌濃度在第一批中升高，然后在第二批中降低（圖2C）。

圖2.通過(guò)坑坑中原核生物的16S rRNA基因分析對(duì)

（a）OTU進(jìn)行主成分分析。 （b）最豐富的原核生物種類的比例。 （c）梭菌和乳桿菌的16S RNA基因拷貝的平均數(shù)。 （d）預(yù)測(cè)與糖和有機(jī)酸代謝有關(guān)的KEGG同源物的豐度。 A.初期階段； B，第一批； C，第二批； D，第三批； E，第四批。

4。 Lu州風(fēng)味酒的原核生物群落與理化性質(zhì)和主要風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系

皮爾遜人工坑泥與最豐富的原核生物的理化性質(zhì)之間的相關(guān)性分析表明，總氮，有效磷和有效鉀與15個(gè)屬有關(guān)（ 圖3a）。 在15個(gè)屬中，有6個(gè)屬與Lu州風(fēng)味酒樣品中的8種以上主要風(fēng)味化合物有關(guān)（圖3b）。

圖3主要原核生物與理化性質(zhì)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)

（a）人工窖泥（b）zhou州風(fēng)味酒樣品的風(fēng)味成分。

5。 人工坑泥

的原核生物群落的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。 接下來(lái)，為了更好地了解Lu州風(fēng)味酒的功能變化及其與質(zhì)量的關(guān)系，作者分析了第一批和第四批人工窖泥樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。 通過(guò)TMT蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定出213種原核蛋白。 三個(gè)最豐富的類別占原核蛋白的78.39％（圖4A）。 Negativites（32.39％）是最豐富的類別，其次是梭菌（23.00％）和桿菌（23.00％）。 鑒定出的蛋白質(zhì)來(lái)自70屬，包括乳桿菌，梭狀芽胞桿菌和孢子菌（18.31％，9.86％和5.16％）。 鑒定出來(lái)自24個(gè)屬的47種差異蛋白，主要是乳酸桿菌（圖4C）。 對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)，最大的變化發(fā)生在代謝過(guò)程中，包括ADP代謝，嘌呤核糖核苷二磷酸代謝和嘌呤核糖核苷二磷酸代謝（圖4D）。

圖4 | 第一批和第四批人工坑泥樣品

中原核生物群落的元蛋白質(zhì)組分析（a）基于分類的原核生物分類。 （b）基于屬的原核生物分類。 （c）差異蛋白。 （d）富集差異蛋白。

6。 人工坑泥的代謝組學(xué)分析

非目標(biāo)代謝組學(xué)分析確定了7478種代謝產(chǎn)物。 GC-MS代謝組學(xué)和LC-MS代謝組學(xué)可以清楚地將opls-da中的批次分開(kāi)（圖5a-d）。 在第四批人工礦井泥樣品中，分別有491種和523種代謝產(chǎn)物上調(diào)和下調(diào)。 差異代謝產(chǎn)物分為16個(gè)功能組（圖5F）。 脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子最多（38.07％），其次是雜環(huán)化合物（16.17％）和有機(jī)酸及其衍生物（13.11％）。

圖5 |

為第一批和第四批人工礦渣樣品的代謝組學(xué)分析提供了散布圖（A和b）和相應(yīng)的交叉驗(yàn)證圖（C和D）。 其中（A和C）來(lái)自GC-MS，（B和D）來(lái)自LC-MS。 差異代謝物的強(qiáng)度水平（E）和官能團(tuán)（f）。 （g）己酸，丁酸和乳酸的平均水平。

7。 Lu州風(fēng)味液中決定香精酯的關(guān)鍵物質(zhì)的合成代謝途徑

Lu州風(fēng)味液中決定香精酯的關(guān)鍵物質(zhì)的合成p4人工坑泥樣品中己酸的含量高于 在第一批人工礦坑泥漿樣品中（P ＜0.05），而丁酸和乳酸的含量較低（P ＜0.05）（圖5g）。 基于KEGG富集的分析，確定了己酸，丁酸和乳酸的代謝途徑（圖6）。 在許多方面，丁酸代謝和丙酮酸代謝直接參與己酸，丁酸和乳酸的生產(chǎn)。

圖6人造坑泥中己酸，丁酸和乳酸的合成途徑，蛋白質(zhì)，代謝產(chǎn)物和物質(zhì)的示意圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

這項(xiàng)多層組織化學(xué)研究確定了分類基團(tuán)的特定功能和代謝途徑在 人工泥漿成熟的過(guò)程。 結(jié)果揭示了原核生物群落中的幾個(gè)成員與人工坑泥中代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)之間的關(guān)鍵關(guān)系。 這些候選微生物，蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物可能是預(yù)測(cè)人工窖泥質(zhì)量和發(fā)酵狀態(tài)的指標(biāo)，這將有助于進(jìn)一步優(yōu)化人工窖泥的培養(yǎng)技術(shù)，提高Lu州風(fēng)味酒的質(zhì)量。

小鹿建議

zhou州風(fēng)味酒占中國(guó)白酒總產(chǎn)量的70％以上。 自1960年代以來(lái)，在中國(guó)白酒釀造行業(yè)中，人工窖泥已廣泛用于建造發(fā)酵窖，以生產(chǎn)高品質(zhì)的濃香型白酒。 為了進(jìn)一步了解人工窖泥的原核生物分類和功能動(dòng)力學(xué)機(jī)制，以及這種變化與優(yōu)質(zhì)Lu州風(fēng)味酒的生產(chǎn)之間的關(guān)系，該研究首先進(jìn)行了宏觀基因組學(xué)，宏觀蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析。 釀造微生態(tài)。 該多組分方法可以更全面地了解優(yōu)質(zhì)zhou州風(fēng)味酒生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落的代謝過(guò)程，有助于進(jìn)一步優(yōu)化人工窖泥的培養(yǎng)工藝，提高Lu州風(fēng)味酒的質(zhì)量。 在

結(jié)束時(shí)，我們使用基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的多層次研究方法，并使用PRM目標(biāo)驗(yàn)證技術(shù)來(lái)探索礦泥質(zhì)量和發(fā)酵狀態(tài)的目標(biāo)。 鹿鳴生物學(xué)是中國(guó)早期的團(tuán)隊(duì)，主要進(jìn)行基于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的多層次組織化學(xué)整合實(shí)驗(yàn)和分析。